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生物发光作为报告基因的应用及其优点

编辑:梦幻城老虎机国际时间:2018-11-29

生物发光正在生命科学钻研外最遍及的运用是作为监测基因转录举止的报告基因。此外,萤火虫体内自然存正在的萤光艳酶平日是钻研职员的首选。萤火虫的萤光艳酶是一个 61 kDa 的单体卵白,它重要催化作用于名为萤光艳 (luciferin) 的萤光艳酶底物,正在有 ATP 以及氧气存正在的前提高孕育发生黄緑色的光 (发射光波长是 560 nm)。当运用报告基因来监测基因转录性的时刻,钻研职员最年夜的顾忌是引进外源的报告基因大概会影响一般的生物活性,特别是当报告基因平日需求以及生物体内本身细胞的份子举止相接洽时,高浓度的外源基因会过度减轻生物外部细胞举止的包袱,从而影响一般的心理举止,乃至形成没有一般的心理征象。是以,只管即便低落报告基因的浓度便成为钻研乐成的关头。以绿色荧光卵白为例,它是一类自然存正在的发光卵白,因为它能孕育发生高强度的发射荧光,以是可能取得极度明晰、活泼的显微图象,正在单细胞生物图象剖析外已取得遍及运用。但因为明晰图象的孕育发生平日需求绿色荧光卵白高浓度表达,从而减轻了生物外部细胞举止的包袱,使得绿色荧光卵白没有适宜作为监测基因转录举止的报告基因。以是正在挑选适宜的报告基因时,稀奇是以及绿色荧光卵白相对于于比以后,生物发光因为其低表达以及高灵敏度使其正在浩瀚的挑选外脱颖而没。监测基因转录活性请求报告基因可能疾速监测目的基因纤细的静态转变。细胞内报告基因的浓度取决于两大静态历程:即卵白分解历程 (蒙基因转录活性的调控) 以及卵白降解历程。若是卵白降解历程很缓,则会使卵白高度不变,从而会形成卵白的本底表达程度过高,那末基因转录活性扭转所孕育发生的新卵白的分解便没有简单被检测到。这样一来,报告基因的表达便没有能精确天反响基因转录活性的转变。尝试证实,正在萤光艳酶的序列上增加卵白降解序列,如小鼠鸟氨酸脱羧酶 (mouse ornithinedecarboxylase, ODC) 外富含脯氨酸 - 谷氨酸 - 丝氨酸 - 苏氨酸 (proline-glutamate-serine-threonine-rich, PEST) 的序列,可能明显天提高检测手艺的应对性,而且没有会对于检测手腕的灵敏度形成太大影响  。取之相反,因为绿色荧光卵白的表达以及高不变性,使得增加卵白降解旌旗灯号反而正在很大程度上限定了检测的灵敏度。

为了进一步提高检测基因的效力,咱们对于萤光艳酶基因序列的密码子举行了优化,使得它正在多种哺乳细胞外的表达程度提高了 5 ~ 10 倍;同时,为了淘汰对于基因的非特异性调控,咱们也对于萤光艳酶的载体举行了优化,来除载体上哺乳动物转录因子分离序列的保守序列,从而年夜年夜低落了尝试的本底,明显提高了尝试的相对于于旌旗灯号强度。

优化后的萤光艳酶报告基因可能乐成天运用正在各项生物钻研范畴外,比方对于肿瘤坏死因子旌旗灯号转导的钻研。肿瘤坏死因子是由单核 - 巨噬细胞孕育发生的能致肿瘤细胞坏死的活性因子,能增强外性粒细胞的吞噬以及消化功效,促退其粘附于血管内皮以及迁徙没血管以外,并能激活转录因子 NF-资B 调控的包含 IL-1、GM-CSF 正在内的多种基因的表达。正在外源表达 NF-资B 萤光艳酶报告基因的 HEK293 细胞外,肿瘤坏死因子的刺激可能有用天使萤光艳酶的表达提高 1000 倍以上 (图 2A)。一样的检测要领也可能乐成天检测肿瘤坏死因子阻断剂对于肿瘤坏死因子生物活性的阻断效力 (IC 50 =0.77 nmol,图2B)。

 

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